定制化数据分析(分析案例展示)

  

 

项目背景介绍

1. NK细胞概述
自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)是机体重要的免疫细胞,不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关,而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞确切的来源还不十分清楚,一般认为直接从骨髓中衍生,其发育成熟依赖于骨髓的微环境。
1.1自然杀伤活性
由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制,不依赖抗体,因此称为自然杀伤活性。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等,因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素,也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。
1.2分泌细胞因子
活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子,发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。NK可选择性地杀伤病毒感染的靶细胞。病毒感染细胞表面的病毒抗原和其它表面分子使得其对NK的杀伤细胞作用变得更加敏感。自然杀伤细胞属于粒状淋巴细胞,是人体免疫系统的组成部分。它能迅速溶解某些肿瘤细胞,因此开发它的抗癌功能是近年来癌症研究的重点。
2 B细胞概述
B淋巴细胞(blymphocytes)简称B细胞来源于骨髓的多能干细胞。B细胞在抗原刺激下可分化为浆细胞,合成和分泌免疫球蛋白,主要执行机体的体液免疫。淋巴细胞是白细胞的一种,由淋巴器官产生,机体免疫应答功能的重要细胞成分。包括T细胞、B细胞和NK细胞等亚类,分别介导机体的细胞免疫、体液免疫和对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤作用等免疫学功能。
2.1 分化途径
B细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较T细胞多,在血液和淋巴结中的数量比T细胞少,在胸导管中则更少,仅少数参加再循环。B细胞的细胞膜上有许多不同的标志,主要是表面抗原及表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。从骨髓来的干细胞或前B细胞,在迁入法氏囊或类囊器官后,逐步分化为有免疫潜能的B细胞。成熟的B细胞经外周血迁出,进入脾脏、淋巴结,主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中,受抗原刺激后,分化增殖为浆细胞,合成抗体,发挥体液免疫的功能。
2.2 免疫细胞
T细胞不产生抗体,而是直接起作用。所以T细胞的免疫作用叫作“细胞免疫”。大多数抗原物质在刺激B细胞形成抗体过程中;需T细胞的协助。在某些情况下,T细胞亦有抑制B细胞的作用。如果抑制性T细胞因受感染、辐射、胸腺功能紊乱等因素的影响而功能降低时,B细胞因失去T细胞的控制而功能亢进,就可能产生大量自身抗体,并引起各种自身免疫病。

 

样本数据生物信息分析结果

3.1 标准化(Normalization)
首先,我们对原始数据进行CEL文件解析。其次,使用RMA对数据进行标准化。其中,B细胞为实验组(Case组),NK细胞为对照组(Control组)。芯片内的数据标准化,主要是去除每张芯片的系统误差,这种误差主要是由荧光染色差异,点样机器,或者杂交试验所产生的,通过标准化,使每个基因的表达都具有独立性。
3.2 差异表达分析(Difference Expression)
3.2.1 差异mRNA表达分析
通过基于贝叶斯的Limma模型对Control组和Case组进行差异mRNA筛选(Dif-Gene-Finder),命名为Dif-mRNA(图3.2-1)。其中logFC>1或LogFC<-1 ,P-value<0.01,FDR<0.01。共得到1051条下调差异探针,2687条上调差异探针。并对其进行聚类分析(图3.2-2)。

 

差异mRNA聚类图呈现一个明显的“田”字格,表明本次试验样本数据较好,可用于后续的生物信息分析。

 

3.2.1 差异microRNA表达分析

用limma算法对Case组和Control组miRNA进行差异筛选,命名为Dif-miRNA(图3.2-3)。差异miRNA筛选采用limma算法。其中,logFC>1或LogFC<-1,P-Value<0.01,FDR<0.01。共得到30个差异miRNA。

 

以差异miRNA为研究对象,通过搜索TargetScan数据库,得到差异miRNA调控的所有靶基因,共9283个,命名为Difference-miRNA-Target(图3.2-4)。

 

对差异筛选出来的mRNA和差异miRNA的靶基因进行负相关取交集,得到659个交集基因,命名为Difference-mRNA&Target(图3.2-5)。

 

3.3 基因功能分析(GO Analysis)

3.3.1 差异mRNA的基因功能分析

面对3738条B细胞与NK细胞之间的差异基因,我们以显著性mRNA为研究对象,两组组间筛选出的差异基因基于NovelBio数据库*进行GO注释,得到基因参与的所有GO,采用Elim Fisher检验计算每个GO的显著性水平(P-Value),从而筛选出差异基因富集的显著性GO,命名为GO-Analysis-mRNA。其中,P-Value<0.01。共得到48个显著性上调的GO-Term和83个显著下调的GO-Term。

 

通过对差异mRNA的基因功能分析,我们发现B细胞与NK细胞之间的3738条差异基因显著富集在131条GO Term中。其中,上调GO Term大致可归为以下几类:(1)代谢相关功能。如:gene expression,translation,translational initiation,translational elongation,RNA splicing,translational termination,regulation of transcription, DNA-dependent,RNA metabolic process和transcription, DNA-dependent等(2)免疫相关功能。如:T cell costimulation,B cell activation,T cell receptor signaling pathway,humoral immune response和B cell receptor signaling pathway等;下调GO Term大致归为以下几类:(1)免疫相关功能。如regulation of immune response,immune response,cell surface receptor signaling pathway和leukocyte migration(2)癌症相关功能。如tumor necrosis factor-mediated signaling pathway和positive regulation of mesenchymal cell proliferation等(3)炎症相关功能。如:cell adhesion,negative regulation of inflammatory response和inflammatory response等。

 

3.3.2 差异mRNA和差异miRNA靶基因的交集基因的功能分析

以差异筛选出来的mRNA和miRNA比对出来的靶基因取交集,得到的659个交集为研究对象,两组组间筛选出的差异基因基于NovelBio数据库进行GO注释,得到基因参与的所有GO,采用Elim Fisher检验计算每个GO的显著性水平(P-Value),从而筛选出差异基因富集的显著性GO,命名为GO-Analysis-Target&mRNA。其中,P-Value<0.05。共得到13个显著性上调的GO-Term和32个显著下调的GO-Term。

 

通过差异mRNA和差异miRNA靶基因的交集基因的功能分析,我们发现659个差异交集基因的功能显著集中在45个GO Term中。其中,上调GO Term大致可以归为以下几类:(1)发育相关。如:lateral mesoderm development,extracellular matrix assembly等(2)代谢相关。如:zinc ion transmembrane transport,glycolipid transport等;下调GO Term大致可以归为以下几类:(1)炎症相关。negative regulation of cell-cell adhesion mediated by cadherin,regulation of interleukin-13 biosynthetic process,interleukin-13 biosynthetic process。(2)甲基化相关。histone methylation,protein methylation,histone lysine methylation,histone H3-R17 methylation等。(3)发病相关。如:pathogenesis。

 

3.4 信号通路分析(Pathway-Analysis)

3.4.1 差异mRNA的信号通路分析

以3738条B细胞与NK细胞之间的差异基因为研究对象,我们在信号通路层面进行注解。以显著性mRNA为研究对象,将两组组间筛选出的差异基因基于NovelBio数据库进行Pathway注释,得到基因参与的所有Pathway Term,采用Fisher检验计算每Pathway的显著性水平(P-Value),从而筛选出差异基因富集的显著性Pathway Term。其中,P-Value<0.05。共得到26个显著性上调的Pathway-Term和37个显著下调的Pathway-Term。

 

通过对差异mRNA的基因功能分析,我们发现B细胞与NK细胞之间的3738条差异基因显著富集在63条Pathway Term中。其中,显著上调的Pathway可以归为以下几类:(1)癌症相关。如:Cell cycle,Small cell lung cancer等。(2)免疫相关。如:B cell receptor signaling pathway,Intestinal immune network for IgA production,Autoimmune thyroid disease和Primary immunodeficiency等;显著下调的Pathway可以归为以下几类:(1)癌症相关。如:Pathways in cancer,Small cell lung cancer,Prostate cancer,mTOR signaling pathway,TGF-beta signaling pathway,Non-small cell lung cancer等。(2)炎症相关。Focal adhesion,Cell adhesion molecules (CAMs),Adherens junction等。(3)免疫相关。T cell receptor signaling pathway,Hematopoietic cell lineage和Primary immunodeficiency等。

 

3.4.2 差异mRNA和差异miRNA靶基因的交集基因的信号通路分析

以差异筛选出来的mRNA和差异miRNA预测出的靶基因的659个交集基因为研究对象,将两组组间筛选出的差异基因基于NovelBio数据库进行Pathway注释,得到基因参与的所有Pathway Term,采用Fisher检验计算每Pathway的显著性水平(P-Value),从而筛选出差异基因富集的显著性Pathway Term。其中,P-Value<0.05。共得到43个显著性上调的Pathway-Term和18个显著下调的Pathway-Term。

 

通过差异mRNA和差异miRNA靶基因的交集基因的功能分析,我们发现659个差异交集基因的信号通路显著集中在61个Pathway Term中,其中上调的Pathway可以归为以下几类:(1)癌症通路。ErbB signaling pathway,Pathways in cancer,Prostate cancer和Acute myeloid leukemia等。(2)炎症通路。MAPK signaling pathway,Focal adhesion和Adherens junction等;下调的Pathway主要集中在癌症通路,如:MAPK signaling pathway,Pathways in cancer,ErbB signaling pathway,Prostate cancer和Cell cycle等。

 

3.5 GO-Trees

试验中,B细胞与NK细胞的差异基因同时参与了很多显著性GO,我们基于GO的层次结构,将差异mRNA显著聚集的131条GO Term构建功能关系网络(图3.5-1),并以图例的形式展示出来(图3.5-2),揭示试验影响的功能群体,以及显著性功能的内在从属关系。

 

3.6 Pathway-Act-Network

实验中,差异基因同时参与了很多Pathway,我们基于Pathway之间的相互作用调控关系,整理出显著性Pathway的信号通路调控网络(图3.6-1),并以图例形式展示出来(图3.6-2),从宏观层面观察显著性Pathway之间的信号传递关系,揭示多个显著性Pathway中受实验影响的核心Pathway,进而研究影响信号通路之间的调控机理。

 

3.7 Gene-Act-Network

B细胞与NK细胞之间3738个差异基因参与了26个显著性上调的Pathway和37个显著下调的Pathway。不仅如此,一个基因可能参与多个Pathway。因此,基因间的调控过程非常错综复杂。为此,我们将参与显著性Pathway所有基因间的调控关系整理出来,构建信号转导网络(图3.7-1),并以图例形式展示出来(图3.7-2),可以轻松发现基因间信号转导脉络,进而揭示信号转导节点的核心调控基因。

 

3.8 Co-expression-Network

共表达(Coexpression)是指在一组样本中2个基因的表达模式具有很高的相似性。从基因芯片数据中提取的基因共表达关系能够提供非同源基因功能注释的线索,也对蛋白质共表达和相互作用研究提供了一个崭新的思路。共表达网络的基本机理是:将每组基因的信号值提取出来,计算每两个基因之间的Pearson correlation,并设立阈值。当两基因之间Pearson correlation超过阈值时,则认为该两基因之间存在共表达关系。最后将所有具有共表达关系的基因关系构建网络,即为共表达网络。
我们根据显著性Pathway中B cell receptor signaling pathway信号通路及与其直接相关的信号通路对应基因的信号值和Natural killer cell mediated cytotoxic信号通路及与其直接相关的信号通路对应基因的信号值做共表达关系网络图(图3.8-1),得到了关注信号通路对应基因的共表达关系网络图(图3.8-2和图3.8-3)和Case组、Control组共表达关系能力的变化(图3.8-4)。

 

 

3.9 miRNA-Target-Network

通过对miRNA靶基因进行功能及信号转导通路的分析,可以得到miRNA所调控的重要靶基因,NovelBio将miRNA与其对应的靶基因构建miRNA-Target-Network,并用图论的方法得到最为重要的miRNA及其调控的靶基因。
我们将差异基因参与显著性信号通路的基因与差异miRNA对应的靶基因取交集。以交集基因为研究对象构建差异miRNA与靶基因的调控网络(图3.9-1),并以图例形式展示(图3.9-2),得到网络中起核心调控作用的miRNA和被miRNA调控的关键靶基因。

 


 

 

 

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