miRNA芯片数据分析方案

miRNA芯片是从转录后调控层面通过碱基配对杂交来研究miRNA的表达。Novelbio的miRNA芯片分析平台通过差异miRNA对应的靶基因的功能和信号转导通路显著性研究来间接的找到和实验最相关的miRNA。构建miRNA和靶基因的间的相互作用关系,运用图论的方法得到核心miRNA及其调控的靶基因。

 

 

1、用Limma模型筛实验组与正常对照组间的差异miRNA 作为为后期分析的研究对象。
2、对差异miRNA基于Targetscan数据库进行靶基因预测,得到差异miRNA所调控的靶基因。
3、将NCBI、Swissport/Uniport、AmiGO等数据库整合去冗余,把筛选出来的差异基因进行显著性功能分析,运用elim算法考虑GO的层次结构,将非特异GO的信息进行弱化,得到具有显著性、低误判率、靶向性的功能以及对应的靶基因。
4、将KEGG、Biocarta、Reactome等数据库整合去冗余,把筛选出来的靶基因进行显著性信号转导通路分析,基于超几何分布的Fisher精确检验来进行Pathway的显著性分析,得到具有显著性、低误判率、靶向性的Pathway以及对应的靶基因。
5、以显著性Pathway为研究目标,构建Pathway之间的相互关系网络,从宏观、系统的角度研究信号转导过程。
6、构建差异miRNA与靶基因的调控网络(miRNA-Tar-Network),得到网络中起核心调控作用的miRNA和被miRNA调控的关键靶基因。

 

以上图片源自上海烈冰生物客户文献:

MicroRNA-100 inhibits human bladder urothelial carcinogenesis by directly targeting mTOR.Chuanliang Xu, Qinsong Zeng, Weidong Xu, et al..(2013)

 


 

NovelBio的miRNA深度分析

一、microRNA转录因子预测分析
为了探索目标microRNA的上下游调控关系元件,对下载的目标miRNA序列进行基因组定位后,针对目标microRNA,提取TSS上游4500bp序列和下游500bp序列作为转录因子(TF)预测的数据。使用转录因子数据库和转录因子结合位点预测程序完成转录因子预测分析。
二、microRNA 靶基因预测
1. microRNA非编码区靶基因预测项目
对于非编码区靶基因的预测,采用多个软件分别进行预测,对于有些无法对应的目标microRNA可参考miRGator软件。一般取几种软件预测结果的交集,即overlap部分做为最终预测结果。
2. 编码区靶基因预测项目
对于编码区靶基因的预测,提取目标microRNA编码区序之后做多物种比对,搜寻到保守区段后进行靶位点预测,整理保守的靶位点,并进行统计分析。编码区基因也是microRNA结合位点的预测已经很多顶级文章报道。
三、靶基因Gene ontology分析
对差异基因进行相应的生物学功能分类,采用GO 数据库中的功能聚类注释结果,并根据统计检验方法(P-value)筛选显著显异的分类。最后针对客户的需求进行结果的输出。
四、靶基因pathway分析
建立信号通路和生物功能网络,将差异基因与相关的信号通路进行比较、整合,找出基因之间的相互关系,进行通路动态仿真。并根据统计检验方法(P-value)筛选显著显异的代谢通路,已期对致病基因构建模拟疾病状态的通路网络,对目的基因进行分析,以期发现目的基因与疾病之间在生物学通路或生化途径上的关联。
五、microRNA启动子分析
该项目用于研究MicroRNA的自我调控机制。方法是提取microRNA的启动子区域,通过PWM等算法来寻找转录因子的结合位点。
六、microRNA 启动子甲基化分析
为了探索甲基化对目标microRNA的影响,下载目标microRNA的启动子区域序列,并通过相关算法寻找目标microRNA可能的甲基化位点(CpG island),并设计四对引物:一对甲基化,一对未甲基化引物以指导实验(MSP-PCR的方法)验证。
七、lncRNA与miRNA的相互作用关系分析
作为非编码领域的两颗新星-miRNA和lncRNA,最近研究表明,miRNA和lncRNA功能之间可以产生相互调控作用,Novelbio技术平台可以通过相互调控作用构建靶向互作网路。
八、microRNA 在不同组织、细胞中的表达分析
为了考察microRNA在不同组织、细胞中的表达情况,利用不同组织、细胞中克隆测序数据,计算目标miRNA 的相对表达量。表达量用测序miRNA copy数除以相应组织中miRNA copy总数再乘以1000,即copies per kilo,分析所有的组织、细胞系、肿瘤中microRNA 的表达。
九、调控网络分析
对于一些转录因子,本身可以结合在microRNA的启动子区域,调控microRNA。而该microRNA同时又可能也结合在转录因子的3’ UTR下调该转录因子。这本身就是一个网络。方法是靶基因预测与启动子分析进行综合分析。
十.数据结果的深入挖掘:
1. 利用miRNA芯片数据筛选特异分子标志物
采用Prediction Analysis for Microarrays(PAM)分析工具,可以最终对miRNA芯片数据进行处理,筛选出最小数目的分子标志物。相对于传统方法,PAM方法筛选出的分子标志物准确性高,可靠性强。数据要求:已知类型的样本,每组类型样本数量大于10个。
2. 根据miRNA芯片数据筛选miRNA并进行下游功能分析
根据芯片统计学分析结果,筛选表达有显著差异的miRNA:
a. 应用载体进行miRNA过表达分析gain-of-function的表型,或应用knockdown探针进行loss-of-function分析
b. 通过预测网站预测miRNA的靶基因。对于单个靶基因,可应用miRNA报告基因系统检测miRNA对靶基因的调控作用;对于更大规模的靶基因研究,则可以利用芯片对靶基因做大规模筛选。
十一、Biomarker预测


 
 
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