circRNA建库方法

 

    目前主流的circRNA建库方法有两种:去核糖体建库和RNaseR去线性建库。

  • 去核糖体建库(ribo-free):核糖体RNA,即rRNA,是3类RNA(tRNA,mRNA,rRNA)中相对分子质量最大的一类RNA,也是最多的一类RNA,占RNA总量的82%左右。所以在测序前,我们必须把核糖体RNA去除干净,才能得到有用的信息
  • RNase R去线性建库(RNase R enrichment):RNase R是一种核糖核酸酶,可以有效降解线性RNA,包括mRNA,lncRNA等等~但,已有多篇文献证明, circRNA对RNase R 有一定抗性[1, 2,3],可以从RNase R的魔掌中存活下来。

建库包含哪些信息?

  去核糖体建库可获得全部circRNA,lncRNA和mRNA信息。RNase R仅能获得部分circRNA。 

去核糖体相较于RNaseR有哪些优势?

1.机制解释
      上文已经介绍过,去核糖体建库可以获得全部circRNA、lncRNA和mRNA信息。从分析的角度来看,circRNA作为一个非编码产物,将其作为Biomarker,需要对于其作用机制进行一定程度的探讨,而没有mRNA的测序结果单纯进行miRNA海绵的分析是不可靠的手段。其分析的miRNA海绵的机制并没有mRNA的支撑,对于表型的影响难以界定,即使界定也缺乏真实转录组依据,会存在一定程度的影响。 利用去核糖体建库最大的优势,就是可以进行联合分析,进一步准确地解释circRNA可能的机制。 如WGCNA功能预测,根据基因表达模式进行分类,每一个类群代表具有类似的表达模式,可以把作用相似的circRNA、lncRNA、mRNA都归为一类,同时说明这些circRNA和lncRNA具有mRNA相同的GO&Pathway。WGCNA如下图所示。

2. 背景清楚
      circRNA对于host基因分析很看重,本文所引用的大部分高分文章都探讨了这个问题,这是需要mRNA测序结果支撑的。同时检测circRNA和mRNA的目的就在于此,目的是要对于原位基因进行探讨。RNase R去线性建库去掉了mRNA,造成的直接影响就是:无法判别circRNA的富集情况。没有了mRNA这个参照,无法判别circRNA到底是多是少,自然也无法对原位基因进行探讨。如果使用不经任何处理的样品作为参照,已有文献证明,会增加一定程度的背景误差。这一比较非常有意义,事实上,如下图所示,有相当多的circRNA含量比原位的mRNA还要高。


3.circRNA全面
      已有研究表明,在使用RNase R去线性建库时,一些circRNA也会被RNase R降解,导致circRNA信息不全面。例如,JeckWR等人已经证实,CDR1as/ciRS-7就会被RNase R降解,并不会出现在建库信息中。不仅如此,一篇发表在NatBiotechnol上的文献指出,RNase R去线性建库主要依据的是lariats end,但有一些线性RNA的3'端修饰后导致RNase R不能识别,直接造成去线性过程不彻底。同时,该文献还指出,RNase R去线性建库也会有3‘保护的lncRNA存在,也并不是纯粹的circRNA,因此也会存在影响。而采用去核糖体建库对circRNA有较好的检测精度,完美避免这一系列问题,并且能检测mRNA & lncRNA,如下图所示。

 

国际大牛们是如何选择的?

      为了推荐更有说服力,让我们看看国际大牛们是怎么选择的吧!下图即为统计的2012—2015 circRNA发表文章所采用的建库和鉴定方法等。可以发现,随着时间的推移,越来越多的文章放弃了RNase R去线性建库,转而使用去核糖体建库,这已经是circRNA前沿研究的大势所趋。

  • 案例1:《Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conservedand Dynamically Expressed》:Mol Cell. 2015 Jun 4; 58 (5): 870-85

  本研究采用实验测序数据和数据库数据相结合的方法,研究不同物种大脑中circRNA的表达,期望揭示circRNA在神经系统的表达特点。
下图是烈冰科技研究人员总结的实验流程图,

       结果显示,在不同的脑部位以及神经细胞的不同结构,circRNA的表达量不同,表达水平存在明显差异。

       继而对不同发育时期的胚胎脑皮质神经元进行研究,发现:随着分化程度的升高,绝大多数circRNA的数目增多。后续挑选差异表达最明显的circRNAs进行qRT-PCR验证,结果一致。




      同时发现,在小鼠大脑中鉴定出的circRNAs,有4522个在人脑中也同时表达。挑选其中保守性最强的19个circRNA,利用RNaseR去线性建库进行验证,保守性得到证实,甚至某些circRNA在果蝇脑中也能鉴定出来。总结:本文发现,在大脑中,circRNAs具有明显的表达和序列保守性。同时还提供了circRNA脑内表达图谱和重要circRNA功能及其作为生物标记的证据。

      尤其值得我们借鉴的是,本文利用去核糖体建库法进行前期筛选,再利用RNase R去线性建库进行后期验证,绝不仅仅是一家之言,有兴趣的主公还可以查看这篇文章:Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulatedby development and plasticity。

我们的建议

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参考文献

1.   [1] .Jeck WR, et al. Circular RNAsare abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA 2013, 19:141157.

2.   [2].Memczak S, et al. Circular RNAsare a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 2013, 495:333338.

3.  [3] . Suzuki H, et al. A view ofpre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. Int J Mol Sci 2014, 15:93319342.

4.  [4] .Rybak-Wolf A,et al. Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved andDynamically Expressed. Mol Cell. 2015 Jun 4;58(5):870-85.

5.   [5].Jeck WR,et al. Detecting and characterizing circular RNAs. Nat Biotechnol. 2014May;32(5):453-61. 

6.  [6] . Chen I,et al. Biogenesis, identification,and function of exonic circular RNAs. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2015Sep-Oct;6(5):563-79.

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