双单倍体牙鲆de novo RNA-seq研究

 
 

  在硬骨鱼中,卵裂雌核发育诱发的双单倍体(DHs)往往是不育的。这种不育严重制约着渔业生产和鱼类的遗传育种。然而中国水产科学研究院北戴河中心实验站的研究人员却另辟蹊径,以不育的DHs雌性个体作为探索性腺发育分子机制的材料,用于挖掘鱼类繁殖中不可或缺的基因。2015年上海烈冰高通量测序和生信分析团队协助研究人员,使用Illumina de novo RNA-seq分析了牙鲆雌性不育DHs的转录组,确定了导致不育的主要基因,并为硬骨鱼性腺发育的深入研究奠定了分子基础。研究的成果以Gonadal Transcriptome Analysis in Sterile Double Haploid JapaneseFlounder为题发表在PLoS ONE 10(11)上。

  • 雌核发育(gynogenesis),或称假受精,是一种发育方式,在这种发育方式中,精子虽正常进入激活卵子,但其细胞核在染色体中很快消失,并不参与胚胎的发育,胚胎的发育仅受母体遗传控制。在自然界中主要出现于鱼类和无脊椎动物的繁殖中。
  • 卵裂雌核发育(又称有丝分裂雌核发育):通过抑制雌核发育单倍体胚胎的第一次卵裂而达到染色体加倍的目的。这样获得的雌核发育二倍体为同质雌核发育二倍体,纯合度很高,往往用于遗传连锁图谱构建、快速建立纯系和隐性有害基因的剔除等方面具有重要应用价值。
  • 双单倍体(double haploids (DHs)):由二倍体的单倍体配子细胞,经人工诱导加倍后产生的二倍体个体或者由四倍体的配子细胞孤雌/雄发育产生的二倍体个体。
  • 性别控制:通过人为干预或操作,使动物按照人们的设计繁殖出所需性别后代的技术。例如,牙鲆的雌鱼比雄鱼长得快且个头大,为了提高产量,在养殖育种过程会通过人工诱导的雌核发育而获得更多的雌性二倍体。

 研究内容

 

图1  实验的基本流程

图2  denovo RNA-seq数据分析流程

  高质量的denovo结果需要有高质量的Unigene,也就是拼接后的转录本,作为后续无论是基因注释,还是功能注释的标准,亦或是后期验证的标准,都能够提供大量的便利。

表格 1 trinity拼装的结果

表格 2  unigene组装的结果

  评估一次拼装好坏,入门级就是三个标准,转录本数量,N50(转录本总长加和后,将转录本从小到大排列,前N条转录本的总长为全长一半的,第N条转录本的长度为N50)以及Reads使用率。通过测序、组装和注释,一共获得了52474条unigene,Reads使用率99%以上,N50更是高达2895bp,远超常见的拼接结果,为后面的分析打下了好的基础。

表格 3  unigene注释和blast的结果

  随后帮助客户通过tBlastx分析发现这些unigene与现有序列的同源性达到60.7%。进一步分析发现共有1225条差异表达unigene,其中包括492条上调和733条下调的基因。

  • GO Patyway

图3  差异表达unigene的GO和pathway分析结果

  GO和KEGG分析显示,呈现显著上调的基因,例如CYP11A1、CYP11B2、CYP17、CYP21、HSD3β、BCL2L1和PRLR,主要与固醇的代谢过程、类固醇的生物合成过程、JAK-STAT信号通路相关。而显著下调的基因主要参与了免疫反应、抗原的加工和呈递、细胞因子-细胞因子受体相互作用和蛋白质的消化吸收。

  • 共表达网络  

  • 图4  差异表达unigene的共表达网络分析

      我们还使用共表达网络分析对雌性不育和可育的DHs性腺的基因表达模式做了一个全面的比较。通过共表达分析筛选出的显著差异基因可以作为探索硬骨鱼DHs生殖功能障碍和卵母细胞成熟过程的重要候选基因。

  • qPCR验证

    表格 4  qPCR验证的结果
 

结论

  这项研究利用de novo RNA-seq技术对牙鲆可育和不育DH的性腺做了一个全面的比较转录组研究。鉴定了负责性腺发育的诸多基因。并通过进一步的分析,推测到参与类固醇合成的基因表达下调可能会影响卵巢的发育,并可能导致牙鲆DH的不育。另外该研究还发现,与细胞凋亡和卵黄蛋白的消化吸收相关的基因在不育的DH性腺具有更高的表达量。这些结果表明,不育的DHs性腺中的卵母细胞有可能会逐渐凋亡,而他们的蛋白可能被消化吸收,获得的能量可能会被重新分配。这些基因表达模式的显著变化,可以成为解释DH生殖功能障碍的分子基础,也可以成为解释牙鲆的卵子发生和卵母细胞成熟的分子机制。

 

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