烈冰生物助力HBx蛋白表达的肝细胞中miRNA-mRNA表达谱整合分析

日期:2017-12-14 14:15:49
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        中南大学湘雅医院范学工教授课题组通过高通量测序手段,对表达HBx基因的肝细胞中miRNA-mRNA之间的相互调控进行研究,研究成果发表于World Journal of Gastroenterology烈冰在该工作中提供了高通量测序和生物信息分析服务及技术支持。

       肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,俗称“癌中之王”。据统计,每年有超过74.5万的患者因HCC死亡,对其发病机制、诊断方法和治疗手段的研究更是如火如荼[1,2]流行病学调查表明,长期慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染是导致HCC的主要病因,这种情况在亚洲更为常见[3]。近年来研究发现乙型肝炎病毒X基因(Hepatitis B Virus X, HBx)在HBV相关HCC的发生发展中发挥重要的作用,肝细胞中HBx基因的表达会导致细胞增殖、细胞信号转导、蛋白降解及凋亡[4-9],但具体的分子机制尚有待阐明。miRNA作为一类内源性小分子RNA,参与基因表达、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。已有研究表明有多个miRNA家族,例如miR-122、miR-125、miR-199等,与HBV相关HCC的发生密切相关[10]。

       本篇文章以“Integrated analysis of microRNA and mRNA expression profiles in HBx-expressing hepatic cells”为题发表于 World Journal of Gastroenterology杂志,研究团队来自中南大学湘雅医院范学工教授课题组,NovelBio在该工作中提供了高通量测序和生物信息分析服务及技术支持。该研究对转染HBx基因的肝细胞进行了转录组测序(RNA-Seq)和miRNA测序(miRNA-Seq),并通过对测序数据的分析绘制了miRNA-mRNA核心调控网络,为HBV相关HCC的分子机制研究提供了新的思路和研究靶点。

Methods

研究者建立了可稳定表达HBx基因的人类肝脏细胞系L02,命名为L02/HBx,作为实验组;以转染了空白质粒的L02/pcDNA作为对照组,分别进行mRNA-Seq和miRNA-Seq,筛选出L02/HBx组中发生差异表达的mRNA和miRNA。之后借助GO分析和KEGG Pathway富集分析来评估候选分子标志物(Biomarker)的功能,并通过调控网络图的构建分析差异miRNA和mRNA的相互作用关系。

分析思路

Results

差异基因表达谱分析

 

       首先,研究者通过比较两组细胞的转录组测序数据,在L02/HBx细胞中筛选出1243个差异表达的基因,其中742个基因表达上调,另外501个基因表达下调(Figure1A)。研究者接着分别对这两组基因中上调和下调差异较显著的20个基因做了聚类分析(Figure1B)。

 

 

Figure1A. L02/HBx和L02/pcDNA细胞的RNA-Seq整体差异基因表达谱

 


 

Figure1B. 差异较显著的20个上调基因和20个下调基因

 

 

从这些差异基因中,研究者进一步锁定了5个上调基因---GPR6KLHL31FOXC1UGT1A7 MAGEA4,以及4个下调基因---SLC22A14PCOLCEA2MKIAA1522,这些差异基因分别参与了DNA复制、细胞周期、细胞增殖、细胞粘附、代谢进程、肿瘤转化等信号通路。研究者通过qPCR对这9个候选基因的表达进行定量验证,定量结果与测序结果完全一致(Figure1C, D)。

 

Figure1C. 候选差异基因的qPCR验证


 

Figure1D. 测序结果与qPCR定量结果的相关性分析


GO/KEGG Pathway富集分析

 

为了阐明差异表达的基因与HBx相关HCC的发生发展的相关性,NovelBio团队协助研究者对1243个差异基因进行了GO功能富集分析和KEGG Pathway富集分析(Figure2A,B)。

 

Figure2A.差异基因的GO功能富集分析

 

 

Figure2B.差异基因的KEGG Pathway富集分析


miRNA表达分析

 

完成对差异基因的分析之后,文章接着对miRNA的表达进行差异筛选。结果显示,与L02/pcDNA细胞相比,L02/HBx细胞中6个miRNA表达发生下调,16个miRNA表达上调(Figure3)。研究者对其中4个差异miRNA进行 qPCR表达量验证,验证结果与测序结果一致。

Figure3. L02/HBx细胞与L02/pcDNA细胞之间发生差异表达的miRNA

 

miRNA和mRNA表达谱整合分析

 

考虑到通过网络图锁定核心miRNA群具有较高的预测准确度,研究者采用以下策略对L02/HBx细胞进行miRNA-mRNA调控网络的构建(Figure4A)。

 

Figure4A. miRNA-mRNA调控网络构建策略

 

       通过专业miRNA分析软件miRnada和TargetScan,NovelBio团队协助研究者成功预测出miRNA的潜在靶基因,然后结合靶基因群的表达模式(Figure1A),锁定一系列显著相关的miRNA-mRNA靶向关系。从这些关系中,研究者根据Degree值挑选出11个处于核心地位的miRNA,并绘制了miRNA-mRNA靶向调控网络(Figure4B)。该网络图中,与miR340-5p形成靶向关系的基因数目最多,另外有几个miRNA可通过组合的方式共同调控某些靶基因。

 

Figure4B. miRNA靶向调控网络图

 

为进一步缩小范围,锁定核心miRNA,研究者对这些靶基因进行了功能富集分析,挑选出其中与肿瘤信号通路(譬如DNA复制、基因表达、细胞周期、细胞分裂等)密切相关的基因,绘制核心miRNA-mRNA调控网络(Figure4C)。由该图可以推测,L02/HBx细胞中发生上调的miRNA,如hsa-miR-7-5p和hsa-miR-182-5p,可能抑制了其靶基因MEF2C和GLI3的表达,从而促进了细胞的转化;而L02/HBx细胞中发生下调的miRNA,包括hsa-miR-501-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-324-5p和hsa-miR-488-3p等,则由于表达量的降低减弱了对靶基因(如JAK1、MAPK1、STX3、BCL10等)的抑制效应,这些基因的激活可能会在HBx相关HCC的发生发展中发挥一定的促进作用。

 

Figure4C. 核心miRNA靶向调控网络图

       肝癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂生物学过程,涉及一系列的基因和细胞因子,而miRNA参与的基因调控可能在其中发挥了关键作用。在该篇研究之前已有研究报道多个miRNA,譬如hsa-miR-338-3phsa-miR-29c等,与HBx相关HCC的发展密切相关[11]。但鲜少有研究者将视线聚焦到miRNA和mRNA之间的靶向调控和相互作用。该研究借助二代测序手段,结合深入的生物信息学分析,首次对相关miRNA和mRNA进行了整合分析,绘制了miRNA-mRNA核心调控网络。此项研究成果不仅有望揭示HCC细胞中HBx蛋白诱导细胞恶性转化的分子机制,还为其临床诊断和治疗提供了有价值的诊断标志物和药物靶点。

原文下载链接:europepmc.org/backend/ptpmcrender.fcgi

 

参考文献

1. Jemal A, et al. CA Cancer J Clin 2011; 61: 69-90

2. Ma L, et al. Oncotarget 2015; 6: 25390-25401

3. Okuda K. J Hepatol 2000; 32: 225-237

4. Yang ST, et al. J Hepatol 2013; 58: 1157-1164

5. Shi L, et al. Virus Res 2016; 223: 131-139

6. Murakami S. J Gastroenterol 2001; 36: 651-660

7. Matsuda Y, et al. Med Mol Morphol 2009; 42: 138-142

8. Cheng P, et al. Oncol Rep 2009; 22: 1101-1107

9. Ma NF, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 5061-5068

10. Meng F, et al. Gastroenterology 2007; 133: 647-658

11. Lamontagne J, et al. World J Gastroenterol 2015; 21: 7375-7399

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